本文文章來源于知乎《mRNA疫苗學(xué)習(xí)（下）》作者：卷毛哥的奇跡

 此前AVT小編給小伙伴們分享了一下具有更強(qiáng)免疫原性的mRNA疫苗的相關(guān)知識(shí)，mRNA疫苗需要你了解的知識(shí)可不只有那些哦，本期我們接著聊一聊mRNA疫苗的那些事！

 裸露的mRNA作為一種外源的核酸物質(zhì)，進(jìn)入體內(nèi)后很容易免疫系統(tǒng)識(shí)別和被核酸酶降解，因此直接用裸露的mRNA作為疫苗其藥理作用會(huì)大打折扣。為了提高mRNA疫苗的免疫效率，通常需要特殊遞送系統(tǒng)的輔助。

 mRNA疫苗的給藥方式

 mRNA疫苗的給藥方式非常重要，會(huì)決定mRNA疫苗在體內(nèi)的代謝，及目的抗原蛋白翻譯的效率。例如，如果直接靜脈注射未經(jīng)任何處理的裸露mRNA，就會(huì)被血液中的核酸酶迅速降解。

 mRNA疫苗的給藥也分為系統(tǒng)給藥或者局部給藥，根據(jù)抗原蛋白需要表達(dá)的位置來決定。如果是預(yù)防性疫苗，為了引起較強(qiáng)的免疫反應(yīng)，通常用皮下和肌肉注射的局部給藥。如果是治療性mRNA疫苗通常通過腹腔或者靜脈注射系統(tǒng)給藥（這也包括下文述及的經(jīng)DC細(xì)胞給藥）。

 mRNA疫苗局部和系統(tǒng)給藥

 經(jīng)DC細(xì)胞給藥

 mRNA疫苗另外一種非常重要的給藥方式是通過DC細(xì)胞的轉(zhuǎn)染進(jìn)行給藥，分為體內(nèi)和體外兩種DC細(xì)胞介導(dǎo)的方式。DC細(xì)胞是人體重要的抗原遞呈細(xì)胞，其攝取抗原后可以誘導(dǎo)隨后的免疫反應(yīng)。在體外分離得到人體未成熟的DC細(xì)胞后，可以通過電穿孔技術(shù)轉(zhuǎn)染mRNA，再把轉(zhuǎn)染后的DC細(xì)胞過繼入人體，產(chǎn)生被動(dòng)免疫。但是通過體外DC轉(zhuǎn)染的方式遞送mRNA疫苗對(duì)技術(shù)的要求非常高，需要較長(zhǎng)的體外培養(yǎng)時(shí)間，而且首先需要獲取人體的DC細(xì)胞，在普通條件下難以實(shí)現(xiàn)。另外一個(gè)通過DC細(xì)胞給藥的方式是淋巴內(nèi)給藥，mRNA被直接注射到淋巴內(nèi)，這樣mRNA就可以被淋巴內(nèi)固有DC細(xì)胞獲取，但是這種給藥方式通常需要手術(shù)輔助，導(dǎo)致給藥非常復(fù)雜且?guī)Я舜罅康娘L(fēng)險(xiǎn)。

 因此，經(jīng)DC細(xì)胞給藥的方式不適合預(yù)防性mRNA疫苗的給藥，只有在一些治療性mRNA疫苗的給藥可能會(huì)被使用。

 mRNA經(jīng)體外DC系統(tǒng)給藥（癌癥疫苗）

 mRNA的制劑系統(tǒng)

 為了保證mRNA疫苗的代謝穩(wěn)定性和免疫活性，除了慎重評(píng)估給藥方式外，還需要對(duì)mRNA疫苗的劑型進(jìn)行特殊設(shè)計(jì)。mRNA進(jìn)入體內(nèi)后，首先面臨周圍組中（如：血液）核酸酶的降解，另外還需要穿過具有磷脂雙分子層細(xì)胞膜。因此，mRNA疫苗的制劑系統(tǒng)需要保護(hù)mRNA不被核酸酶降解，而且還需要促進(jìn)mRNA被細(xì)胞（APC、B細(xì)胞和T細(xì)胞等免疫細(xì)胞）攝取。

 已經(jīng)有大量的mRNA制劑系統(tǒng)見諸報(bào)道，其中的很多已經(jīng)進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。這些制劑技術(shù)都是通過形成特殊的mRNA載體，來實(shí)現(xiàn)mRNA疫苗的遞送，這些載體技術(shù)包括：魚精蛋白載體技術(shù)、納米顆粒脂質(zhì)體載體技術(shù)、多聚體載體技術(shù)

 ·魚精蛋白載體：

 魚精蛋白是一種天然的陽離子蛋白，可以把帶負(fù)電的mRNA分子絡(luò)合成納米級(jí)別的核酸顆粒，從而保護(hù)mRNA不被血清中的RNA酶降解；但是由于魚精蛋白和mRNA的結(jié)合太緊密，因此采用這種制劑的mRNA疫苗的蛋白表達(dá)效率會(huì)受限，另外抗原的表達(dá)很大程度上也受到魚精蛋白和mRNA比例的影響。德國(guó)CureVac公司開發(fā)的 RNActive平臺(tái)成功解決了這個(gè)問題，通過RNActive平臺(tái)得到的魚精蛋白-mRNA復(fù)合物其中，魚精蛋白作為TLR7/8拮抗劑可以誘發(fā)Th1細(xì)胞反應(yīng)，mRNA可以表達(dá)目的蛋白誘導(dǎo)特異的免疫反應(yīng)。

 另外，魚精蛋白-mRNA組成的納米級(jí)顆粒還可以進(jìn)一步制備成脂質(zhì)體，這種脂質(zhì)體-魚精蛋白-mRNA的制劑形式，兼有脂質(zhì)體載體和魚精蛋白載體的優(yōu)勢(shì)。

 魚精蛋白制劑及魚精蛋白-脂質(zhì)體制劑示意圖

 ·納米顆粒脂質(zhì)體（Lipid nanoparticles，LNPs）：

 LNP由四部分組成：陽離子脂質(zhì)體、脂質(zhì)體相連的聚乙二醇（增加半衰期），膽固醇（起到穩(wěn)定制劑結(jié)構(gòu)的作用）和磷脂（支持形成磷脂雙分子層）。脂質(zhì)體實(shí)際上是一種人工膜，可以將藥物包封于類脂質(zhì)雙分子層內(nèi)而形成微型泡囊體。

 LNP遞送RNA的原理目前還不完全清楚，但是通常認(rèn)為，LNP通過非共價(jià)親和力和細(xì)胞膜結(jié)合并通過內(nèi)吞作用被攝取，進(jìn)入細(xì)胞后mRNA逃離內(nèi)吞小泡，被釋放到細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)靶蛋白。有意思的是，LNP還可以通過相反的胞吐作用被排出細(xì)胞外，這也是通過LNP進(jìn)行mRNA給藥需要注意的點(diǎn)。mRNA–LNP復(fù)合物的那器官為肝臟，進(jìn)入體內(nèi)后制劑和載脂蛋白E結(jié)合，隨后通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用，被肝臟細(xì)胞攝??；

 細(xì)胞內(nèi)部脂質(zhì)體mRNA疫苗的蛋白表

 ·多聚體載體

 多聚體載體技術(shù)在臨床上的應(yīng)用并沒有脂質(zhì)體類載體廣，但是作為核酸藥物的載體也表現(xiàn)了優(yōu)異特性。多聚體載體通常為陽離子聚合物，陽離子聚合物可以通過靜電作用跟帶負(fù)電的mRNA形成多聚體，最終形成polyplexes或者micelleplexes；micelleplex由陽離子兩親性的共聚物生成，可以聚合形成膠束，通常表現(xiàn)出比polyplex更優(yōu)異的穩(wěn)定性，因?yàn)楹笳卟⒉粫?huì)形成膠束結(jié)構(gòu)。在進(jìn)行多聚體載體設(shè)計(jì)的時(shí)候需要額外考慮多聚體載體的分子量以及帶電荷量，過大的載體分子和過多的載電量通常導(dǎo)致載體和mRNA分子結(jié)合太過穩(wěn)定，而導(dǎo)致mRNA的表達(dá)效率過低。

 在眾多多聚物載體材料中，聚乙烯亞胺（PEI）是最常用的陽離子聚合物，已經(jīng)被廣用作mRNA疫苗的載體；大分子量的聚乙烯亞胺更適合作為自我復(fù)制性mRNA疫苗的載體，因?yàn)樽晕覐?fù)制性mRNA的分子量較且結(jié)構(gòu)復(fù)雜，但是高分子量的聚乙烯亞胺同時(shí)會(huì)帶來較高的毒性副作用，而且高分子量的聚乙烯亞胺對(duì)mRNA的結(jié)合非常穩(wěn)定以至于無法順利的在細(xì)胞質(zhì)中釋放mRNA；但是小分子量的PEI的轉(zhuǎn)染能力有限；除了PEI外還有其他的分子被用來作為載體，例如：甲基丙烯酸二甲氨基乙酯（PDMAEMA）。

 多聚體生成路線

 ·脂質(zhì)體-多聚體納米顆粒載體

 脂質(zhì)體-多聚體納米顆粒載體，顧名思義為脂質(zhì)體載體技術(shù)和多聚體納米顆粒技術(shù)的聯(lián)合使用。在結(jié)構(gòu)上，多聚體材料是載體的內(nèi)核，而脂質(zhì)或脂質(zhì)-PEG包裹著內(nèi)核形成脂質(zhì)體。

 mRNA可以通過兩種形式跟脂質(zhì)體-多聚體納米顆粒載體結(jié)合，第一種方式是結(jié)合在帶正電荷的多聚體核心中，第二種方式是吸附在帶正電荷的多聚體核心外側(cè)。采用第二種方式結(jié)合的mRNA，可能更容易被釋放。

 左：第一種方式；右：第二種方式

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