文獻(xiàn)分享 | 吸入型mRNA LNP治療小鼠特發(fā)性肺纖維化疾病

特發(fā)性肺纖維化（IPF）描述了一種慢性和進(jìn)行性肺部疾病，會(huì)造成永久性肺功能喪失和纖維化重塑。在損傷肺泡修復(fù)過(guò)程中，肺泡II 型上皮細(xì)胞（AT2細(xì)胞）是重要的干細(xì)胞群體，能夠在損傷后自我擴(kuò)增并分化為肺泡 I 型上皮細(xì)胞（AT1細(xì)胞）。考慮到AT2細(xì)胞在治療IPF進(jìn)展中的關(guān)鍵作用，維持AT2干細(xì)胞特性以促進(jìn)肺泡修復(fù)被認(rèn)為是一種有前途的治療策略。

2024-12-13 13:02:44AVT270

特發(fā)性肺纖維化（IPF）描述了一種慢性和進(jìn)行性肺部疾病，會(huì)造成永久性肺功能喪失和纖維化重塑。在損傷肺泡修復(fù)過(guò)程中，肺泡II 型上皮細(xì)胞（AT2細(xì)胞）是重要的干細(xì)胞群體，能夠在損傷后自我擴(kuò)增并分化為肺泡 I 型上皮細(xì)胞（AT1細(xì)胞）?？紤]到AT2細(xì)胞在治療IPF進(jìn)展中的關(guān)鍵作用，維持AT2干細(xì)胞特性以促進(jìn)肺泡修復(fù)被認(rèn)為是一種有前途的治療策略。

與健康肺相比，IPF肺的AT2細(xì)胞中 CYB5R3 mRNA 和蛋白水平的下調(diào)不僅與 NAD+/NADH 失衡相關(guān)的線粒體穩(wěn)態(tài)有關(guān)，還參與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)異常激活；在肺纖維化的病理學(xué)中，持續(xù)抑制骨形態(tài)發(fā)生蛋白-4（BMP4）的信號(hào)會(huì)促進(jìn)AT2異常增殖和成纖維細(xì)胞基質(zhì)合成，導(dǎo)致瘢痕形成和肺泡塌陷。

為此，CYB5R3和BMP4的高表達(dá)都可能有助于恢復(fù)肺上皮胞的纖維化，可作為候選mRNA治療藥物。

基于mRNA的治療已經(jīng)成為各種臨床領(lǐng)域中一種安全且有效的治療形式，例如病毒疫苗、蛋白質(zhì)替代療法、基因組編輯和癌癥免疫療法。然而，mRNA介導(dǎo)的治療高度依賴于優(yōu)化的遞送載體和合適的給藥途徑。霧化吸入作為一種簡(jiǎn)單易行的方法，由于其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，被認(rèn)為是臨床上治療呼吸系統(tǒng)疾病最有前途的方法之一。與此同時(shí)，隨著治療技術(shù)的快速發(fā)展，基于納米顆粒的遞送系統(tǒng)已廣泛用于肺部疾病治療。靶向呼吸上皮細(xì)胞的霧化LNP將是IPF治療中基于mRNA的蛋白質(zhì)替代療法的理想選擇，可以在肺部實(shí)現(xiàn)累積并滯留。但霧化給藥存在強(qiáng)剪切力問(wèn)題，且肺部具有粘膜層、吞噬細(xì)胞等特異性的屏障，這些原因在一定程度上阻礙了吸入mRNA療法的功效。

研究表明，使用肺表面成分作為納米顆粒表面涂層可通過(guò)界面遞送改善在粘液屏障上的擴(kuò)散，可以更好地靶向深層肺組織和上皮細(xì)胞攝取以進(jìn)行藥物遞送。受此啟發(fā)，研究人員將肺表面活性劑中豐富的磷脂二棕櫚酰磷脂酰膽堿（DPPC）摻入LNP成分中，以制備具有粘液滲透性的肺表面活性劑仿生 LNP。

基于以上背景及發(fā)現(xiàn)，山東大學(xué)姜新義教授研究團(tuán)隊(duì)在《Science Advances》上發(fā)表了題為“Realveolarization with inhalable mucus-penetrating lipid nanoparticles for the treatment of pulmonary fibrosis in mice”的創(chuàng)新性研究成果。該團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)了一類基于 γ-氨基丁酸（GABA）的可電離脂質(zhì)并優(yōu)化LNP配方，通過(guò)體外篩選實(shí)現(xiàn)高效 mRNA 遞送。優(yōu)化的 LNP同時(shí)封裝遞送了BMP4和CYB5R3 mRNA，以調(diào)節(jié)AT2干細(xì)胞耗竭并進(jìn)行IPF治療（圖 1）。結(jié)果表明，mRNA-LNP系統(tǒng)在肺上皮細(xì)胞中顯示出高蛋白表達(dá)，擺脫了肺泡塌陷問(wèn)題并延長(zhǎng)了纖維化小鼠的存活時(shí)間，提供了一種可行的臨床對(duì)抗IPF的策略。

圖1 mRNA-LNP 吸入遞送至 AT2 細(xì)胞以逆轉(zhuǎn)上皮干細(xì)胞耗竭治療IPF

? mRNA 遞送的吸入 LNP 的篩選和優(yōu)化

通過(guò)使用簡(jiǎn)單的取代和酯化反應(yīng)將烷基尾和胺基頭與γ-氨基丁酸連接鍵反應(yīng)，生成可電離脂質(zhì)庫(kù)（圖2B）。為了確定最佳的候選處方，按照正交設(shè)計(jì)表制備LNP（圖2C）和表 S1）。涉及到的輔助脂質(zhì)材料：DOPE、DPPC、DSPE-PEG2000和膽固醇。主要包載EGFP mRNA或FLuc mRNA用于后續(xù)體外篩選和體內(nèi)吸入篩選最佳處方（圖2D）。

圖2 吸入mRNA LNPs處方篩選組合方案及制備方法

多種處方的相容性和最顯著的轉(zhuǎn)染效率（圖3A）。為了獲得 GAE14 的最佳配方，表征了五種主要候選配方（GAE14A、GAE14E、GAE14L、GAE14M 和 GAE14N）的大小、表面電荷、mRNA包封率和穩(wěn)定性。結(jié)果表明，五種制劑霧化前后的 zeta 電位沒(méi)有顯著變化，但粒徑和PDI有不同幅度增加（圖3B和C），包封率也有所下降。其中 GAE14M 和 GAE14N 似乎更好地將 mRNA 保留在霧化 LNP 中（圖3D），但霧化后GAE14N 在上皮細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)了最佳的轉(zhuǎn)染效率（圖3E）。考慮到轉(zhuǎn)染效率、理化性質(zhì)的穩(wěn)定性等因素，最后選擇了GAE14N處方來(lái)制備 LNPs。為了改善細(xì)胞對(duì)LNP的攝取，對(duì)LNP進(jìn)行SP-A（肺表面活性蛋白A）抗體修飾（用 DSPE-PEG2000-NHS取代PEG 脂質(zhì)，以相同的方法制備SLNPs），共聚焦激光掃描顯微鏡（CLSM）和流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定顯示MLE12 細(xì)胞中SP-A 抗體修飾的SLNPs細(xì)胞攝取率更高（圖3I）。

圖3 吸入mRNA LNPs處方體內(nèi)篩選試驗(yàn)

篩選出的最佳配方為：SP-A 抗體修飾的GAE14N，脂質(zhì)成分摩爾比：GAE14:膽固醇:DSPE-PEG2000-NHS:DOPE+DPPC =45:25:2.5:10（DOPE/DPPC=3/1）。隨后，同時(shí)封裝BMP4和CYB5R3 mRNA進(jìn)行體內(nèi)外遞送效率、表達(dá)情況、治療效果及生物安全性的評(píng)估。

總之，研究團(tuán)隊(duì)成功開(kāi)發(fā)了一種可吸入的 LNP，顯示出深層肺滲透和胞質(zhì) mRNA 遞送，以介導(dǎo) AT2 細(xì)胞中高效的 CYB5R3 和 BMP4 翻譯。值得注意的是，LNP 通過(guò)抵抗 AT2 干細(xì)胞的耗竭以及成纖維細(xì)胞的異常激活來(lái)重塑肺結(jié)構(gòu)，從而有效地逆轉(zhuǎn)了 IPF。此項(xiàng)工作通過(guò)恢復(fù)上皮干細(xì)胞的功能來(lái)實(shí)現(xiàn)肺泡穩(wěn)態(tài)和修復(fù)，為解決IPF可逆治療中未滿足的需求提供了一種創(chuàng)新選擇。